近日，广西师范大学田新民团队和中国农业科学院深圳农业基因组研究所（以下简称基因组所）周永锋团队在Plant Physiology发表了题为“Phased Telomere-to-Telomere reference genome and pangenome reveal an expansion of resistance genes during apple domestication”的研究论文。该研究基于苹果二倍体T2T参考基因组和泛基因组，揭示了苹果驯化过程中功能基因的获得与丢失情况，并阐明了基因复制、结构变异和基因渗入驱动着栽培苹果抗性基因的扩张。研究结果表明，将野生苹果遗传资源纳入育种计划对于增强苹果抗病性具有重要意义。

栽培苹果（Malus DomesticaBorkh.）是异花授粉的多年生果树，具有重要的经济价值。高度分化的遗传结构、复杂的基因组特征以及高杂合性为全面理解其生物学特性带来了一定的挑战。目前，已发表的参考基因组并未分型且高度碎片化，严重阻碍了苹果遗传研究的进展。此外，野生种质资源的抗病机制研究对于栽培苹果抗性改良也至关重要。

Malus Domesticacv. Golden Delicious（金冠）遍布全球，具有超过百年的栽培历史，是许多现代苹果品种的基础祖先。在本研究中，作者使用Pacific Biosciences high-fidelity（PacBio HiFi）、Oxford Nanopore Technology（ONT）超长读取和高通量染色体构象捕获（Hi-C）技术，成功组装了二倍体端粒到端粒的“金冠”参考基因组（GDT2T）。两个单倍型大小分别为650,775,246 bp和644,751,625 bp。Contig N50为34.58 Mb，较GDDH13的620 kb提高了55.8倍。两个单倍型的Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs（BUSCO）分别达到98.7%和98.6%，表明该组装的高度完整性。HiFi reads的映射率超过99%，验证了组装的精确性。此外，通过评估switch error值（0.94%）和hamming error值（1.05%），进一步证实了分型的准确性。两个单倍型中分别包含30和29个端粒。通过分析转座子（TEs）和已发布的HODOR序列分布情况，作者确定了所有染色体的着丝粒位置。

在两个单倍型中分别鉴定了44,375和44,304个蛋白质编码基因，占BUSCO参考基因集的96.4%和97.0%。其中，1,396个基因是GDT2T_hap1特有的，1,306个基因是GDT2T_hap2特有的，这可能是由于祖先种质的杂交及随后克隆繁殖导致。此外，两个单倍型中分别鉴定出754,611和732,903个TEs，占基因组的61.50%和61.47%。

作者纠正了先前错误组装的区域，尤其是GDT2T_hap1中1号染色体的起始位置和16号染色体的末端，跨越了5,416,121 bp（包括111个基因）和2,722,516 bp（包括63个基因）。此外，作者将一个2.36 Mb的序列成功整合到染色体10上（包括35个基因），该片段包括一个与多元醇生物合成相关的基因（GT7）。对于结构变异（SVs），作者使用Sniffles软件将HiFi数据映射到GDT2T_hap1，成功鉴定出56,852个杂合的结构变异（hSVs），并据此发现了3,323个半合子基因。作者表明苹果中半合子基因比例为7.5%，且与蛋白质磷酸化和防御反应等生物学过程有关。

为了构建苹果的综合基因库，作者对七个苹果种质材料进行了泛基因组分析。所选材料包括四个栽培苹果种质（金冠、嘎啦、Honeycrisp 和HFTH1）和三个野生苹果种质：Malus baccata（Mba）、Malus sieversii（Msi）和Malus sylvestris（Msy），这些种质代表了苹果属植物广泛的遗传多样性。直系同源分析将七个基因组的蛋白质编码基因分为44,989个基因簇。在总基因集中，34.41%为核心基因（存在于7个种质中），63.43%为可有可无的基因（存在于5-7个种质中），而1.15%为私有基因（仅存在于单一种质中）。相比于野生种，栽培苹果中有609个基因家族的基因数量显著增多，这些基因主要富集在细胞呼吸调节、能量获取以及细胞成分大小相关的生物合成过程。相反，野生种中基因含量较为丰富的338个基因家族与氧化磷酸化、戊糖代谢过程、对盐的反应和脱落酸生物合成过程有关。该结果凸显了野生与栽培苹果在次生代谢物合成上的显著差异。此外，通过比较基因组分析，在除Gala_hap2外的苹果基因组中发现了11号染色体上的一个倒位片段（约523 kb）。在该倒位附近鉴定到了29个基因，包括响应环境应激反应的细胞色素P450蛋白，该蛋白可能参与植物防御化合物或杀虫剂的解毒过程。

植物对病原体的抗性可以通过抗性（R）基因来控制，这些基因在不同物种中呈现出独特的进化模式。本研究中，作者系统地检索了12个苹果基因组中的抗性基因类似物（RGAs），并根据蛋白结构域将其分为11个家族，每个基因组包含1,012至1,309个RGAs。栽培苹果的RGAs数量比野生苹果更为丰富，尤其是在2、5、10、15和11号染色体上。此外，栽培品种中的NLR（nucleotide-binding and leucine-rich repeat）基因簇和基因对的数量也显著多于野生品种。58.1%的RGAs为核心R基因，38.8%为可有可无的R基因，3.1%为特有的私有R基因。

为进一步明确野生苹果与栽培苹果中NLR基因的动态演化模式，该研究基于NLR基因构建了系统发育树。结果发现，栽培品种中的基因复制事件比野生种更为普遍，表明基因复制在栽培苹果NLR基因积累中的重要作用。通过分析栽培与野生苹果中RGAs的重复类型，发现约33.4%的RGAs经历了全基因组/片段重复（WGD），25.3%的RGAs经历了分散重复事件。此外，结构变异（特别是插入和缺失）也是影响RGAs的关键机制，其主要影响TNL、CNL、NL和TM-CC类型的RGAs。

为了揭示栽培苹果中抗性基因的起源，作者将栽培种与野生近缘种进行了同源序列比较，旨在确定栽培种中RGAs的祖先物种比例。结果发现，在去除共有RGAs的情况下，GD与Msi的RGAs共享率为39.8%，略低于Msy（40.0%）的共享率，高于Mba（32.3%）的共享率。这表明Msi和Msy对栽培苹果中RGAs的贡献最大。Mba具有较高的抗病性和耐寒性，其经常与栽培品种杂交以增强栽培苹果抗病性。作者在GDT2T_hap1基因组中发现了与Mba高度相似的序列（Chr02: 3,001,525-3,195,910bp），但该序列与Msi和Msy没有共线性关系，这表明GD中可能有来自于Mba的片段渗入。在这一渗入片段中鉴定到两个特异性基因（MDgdA02G000320和MDgdA02G000324），分别为TNL和NL类型。其中MDgdA02G000320的同源基因已被证实与葡萄霜霉病有关。与葡萄相比，苹果的该基因中有10个氨基酸发生了改变，但功能注释显示91.7%的SNP对该蛋白质功能仅有轻微影响，暗示该基因可能在苹果中发挥相似作用。

综上所述，本研究提供了分型的苹果T2T基因组和泛基因组分析，深化了对苹果基因组特征的理解，为未来的遗传育种工作提供了宝贵的参考资源。同时，本研究揭示了苹果驯化过程中基因获得和丢失的动态过程，阐明了基因复制、结构变异和基因渗入是驱动苹果驯化过程中抗性基因扩展的几个关键因素。这些基因组变异为基因组设计育种提供了广泛的遗传信息，有助于将野生资源的抗性基因整合到栽培苹果，以增强栽培苹果的抗性。

广西师范大学（新疆大学）田新民教授、中国农业科学院深圳农业基因组研究所博士后肖华、刘众杰和研究员周永锋为本文的共同通讯作者，基因组所客座博士生苏颖（新疆大学）、杨选文，新疆大学研究生王钰玮和李佳蕾为本文的共同第一作者。基因组所ZhouLab全体成员为本研究提供了建设性意见。本研究获得了新疆生物资源基因工程重点实验室开放课题、国家自然科学基金优秀青年科学家基金（海外）和新疆大学研究生自治区创新项目等资助。